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論文的通訊作者：葉宇軒

論文第一作者：王輝，高斌

論文通訊單位：西湖大學(xué)

近年來(lái)，酶催化劑因其選擇性控制精確、易于改造進(jìn)化和綠色環(huán)保等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到合成化學(xué)家的關(guān)注。自然界中存在一些天然催化羰基去飽和化反應(yīng)的酶，但它們的底物普適性差，難以作為催化劑被廣泛應(yīng)用。為了克服這些局限，西湖大學(xué)葉宇軒課題組從一類底物范圍好、熱穩(wěn)定性高、易于表達(dá)的烯還原酶出發(fā)，成功把其從還原酶改造成去飽和化酶 (圖1b)，建立了一個(gè)通用的酶催化羰基去飽和化反應(yīng)平臺(tái)，合成了一系列含有遠(yuǎn)端四級(jí)手性中心的高價(jià)值環(huán)己烯酮產(chǎn)物 (圖1c)。此酶催化反應(yīng)體系條件溫和、操作簡(jiǎn)單、易于放大，展現(xiàn)出與已有的化學(xué)合成方法互補(bǔ)的反應(yīng)性和選擇性。

圖1. 酶催化羰基去飽和化反應(yīng)。圖片來(lái)源：Nat. Chem.

作者首先建立了結(jié)構(gòu)多樣的烯還原酶庫(kù)，以4-甲基-4-苯基-環(huán)己酮1作為模型底物，在氧氣存在的條件下對(duì)ERED的脫氫反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)CrS和GkOYE表現(xiàn)出較好的活性和對(duì)映選擇性控制。當(dāng)溫度升高時(shí)，去飽和化反應(yīng)性提高 (圖2a)。隨后作者以野生型CrS和GkOYE為起點(diǎn)，利用定向進(jìn)化技術(shù)提高酶催化劑的反應(yīng)效率。單突變體CrS1 (Y27L)、CrS2 (Y27C) 和CrS3 (Y27T) 分別以79% (98:2 er), 88% (98:2 er)和81% (97:2 er) 得到產(chǎn)物2；GkOYE-WT經(jīng)過(guò)三輪進(jìn)化得到一個(gè)三重突變體GkOYE3 (D73G、C26S、Y28V)，可以以很高的效率催化2的生成 (96%，>99:1 er) (圖2b)。

圖2. 反應(yīng)優(yōu)化和定向進(jìn)化。圖片來(lái)源：Nat. Chem.

接著，作者收集了在定向進(jìn)化中獲得的有益突變體，建立了去飽和化酶庫(kù)，并對(duì)反應(yīng)的底物范圍進(jìn)行了探索。作者首先測(cè)試了多種4-烷基-4-芳基取代的環(huán)己酮底物，均具有良好的耐受性 (圖3)。當(dāng)使用含2-氨基苯基的環(huán)己酮作為起始原料8時(shí)，以99% (>99:1 er, >20:1 dr) 的收率得到環(huán)化的產(chǎn)物二氫吲哚酮9。值得注意的是，這種生物催化去飽和化方法對(duì)胺和硫醚等氧化敏感官能團(tuán)表現(xiàn)出高的兼容性。此外，缺電子和富電子雜環(huán)都是能夠在改反應(yīng)條件下被兼容。除甲基外的各種烷基取代基底物也可以實(shí)現(xiàn)高立體選擇性的脫氫。從相應(yīng)的3-羥丙基底物18出發(fā)時(shí)，可以99%收率 (>99:1 er，>20:1 dr) 得到環(huán)化產(chǎn)物八氫色烯-7-酮19。此外，螺環(huán)底物 (20-23) 也能很好地轉(zhuǎn)化。然而，4-羥基苯基的環(huán)己酮24不能被酶催化體系兼容，可能是由于該底物是酶的抑制劑。

圖3. 4-烷基-4-芳基環(huán)己酮去對(duì)稱化脫氫反應(yīng)。圖片來(lái)源：Nat. Chem.

無(wú)需進(jìn)一步的酶工程改造，此去飽和化方法可以輕松擴(kuò)展到具有其它取代基團(tuán)的環(huán)己酮底物。二烷基取代的環(huán)己烯酮25-33可以被高效去飽和化。對(duì)于含有甲基和乙基這兩個(gè)差別很小的取代基的底物34，在沒(méi)有經(jīng)過(guò)定向進(jìn)化的情況下仍然能以62:38 er得到目標(biāo)產(chǎn)物。各類4-羥基-環(huán)己酮底物和4-酯基-環(huán)己酮底物都可以順利的發(fā)生反應(yīng)。此外，甲氧基51、乙酰氧基52和氰基53取代的環(huán)己酮也能被酶兼容。單取代的環(huán)己酮也能成功地實(shí)現(xiàn)去飽和化，以中等至良好的收率和高水平的對(duì)映選擇性得到相應(yīng)的產(chǎn)物54-58。4-羥基-4-炔基環(huán)己酮59在該條件下無(wú)法反應(yīng) (圖4)。

圖4. 其它類別環(huán)己酮的去對(duì)稱化脫氫反應(yīng)。圖片來(lái)源：Nat. Chem.

此酶催化反應(yīng)體系條件溫和，操作簡(jiǎn)單，可以很容易進(jìn)行放大。作者首先對(duì)模型反應(yīng)進(jìn)行了克級(jí)規(guī)模放大 (6.0 mmol)：使用細(xì)胞裂解液可以88% 的產(chǎn)率，>99:1 er獲得產(chǎn)物2，使用凍干裂解液可以81% 的產(chǎn)率、>99:1 er實(shí)現(xiàn)反應(yīng) (圖5a)。此外，作者以克級(jí)規(guī)模高效制備了 (+)-Mesembrine，一種具有血清素再攝取抑制活性的生物堿。通過(guò)酶促去飽和化過(guò)程制備的環(huán)己烯酮產(chǎn)物2是應(yīng)用廣泛的合成前體，能夠高立體特異性的轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的手性化合物62，或是經(jīng)歷底物控制的非對(duì)映選擇性Diel-Alder反應(yīng)，生成了帶有三個(gè)相鄰立體中心的六氫萘酮63 (圖5c)。

圖5. 制備規(guī)模合成和產(chǎn)物衍生化。圖片來(lái)源：Nat. Chem.

最后，作者對(duì)這一反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了探索。此脫氫反應(yīng)的可能機(jī)理是 (圖6a): 底物在酶的活性空腔結(jié)合后，保守的酪氨酸殘基陰離子 (3的Y169) 對(duì)底物進(jìn)行α-去質(zhì)子化，形成烯醇中間體Int1。隨后，一種反應(yīng)機(jī)理是經(jīng)歷路徑A，Int1將β-氫負(fù)轉(zhuǎn)移至FMNox，得到去飽和化的烯酮產(chǎn)物2和FMNhq。此反應(yīng)途徑與ERED催化的天然還原過(guò)程相反，符合微觀可逆性原理。另外一種反應(yīng)機(jī)理是經(jīng)歷路徑B，Int1與FMNox進(jìn)行單電子轉(zhuǎn)移 (SET)，生成相應(yīng)的α-?；虚g體Int2和黃素半醌FMNsq，然后進(jìn)行質(zhì)子轉(zhuǎn)移 (PT) 和另一個(gè)單電子轉(zhuǎn)移 (SET) 成2和FMNhq。此反應(yīng)途徑與近期報(bào)道的ERED催化的單電子氧化反應(yīng)類似。最后，在酶催化劑釋放產(chǎn)物2，FMNhq與空氣中的分子氧發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)歷黃素氫過(guò)氧化物中間體，形成過(guò)氧化氫并重新生成氧化態(tài)輔因子FMNox。

基于這個(gè)機(jī)理模型，作者首先利用氫氘交換實(shí)驗(yàn) (圖6b) 和基因敲除實(shí)驗(yàn) (圖6c) 證明了Y169氨基酸殘基對(duì)去飽和化反應(yīng)的重要作用。自由基鐘實(shí)驗(yàn)結(jié)果與β-氫負(fù)轉(zhuǎn)移機(jī)制一致 (圖6d)。接著，作者對(duì)該反應(yīng)獨(dú)特的β-氫負(fù)轉(zhuǎn)移步驟進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)研究，證明了反應(yīng)的決速步是β-氫負(fù)轉(zhuǎn)移。α-和β-位的動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng) (KIE) 與所提出的α-去質(zhì)子化和β-氫負(fù)轉(zhuǎn)移的反應(yīng)途徑一致 (圖6e)。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，定向進(jìn)化后的突變體GkOYE3的催化去飽和化半反應(yīng)速度比GkOYE-WT快約57倍，還原反應(yīng)速度變慢約0.7倍，與氧反應(yīng)速度比GkOYE-WT快約1.5倍。總體而言定向進(jìn)化產(chǎn)生的突變體在所有三個(gè)關(guān)鍵基元步驟中都更適合去飽和化 (圖6f)。

圖6. 提出的機(jī)理，氫/氘交換實(shí)驗(yàn)，動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。圖片來(lái)源：Nat. Chem.

葉宇軒課題組成功的解鎖了烯還原酶的全新非天然去飽和化反應(yīng)性，把它們從還原酶改造成為了去飽和化酶。此創(chuàng)新生物催化去飽和化平臺(tái)展現(xiàn)出與已有方法互補(bǔ)的反應(yīng)性和優(yōu)越的選擇性，具有較好應(yīng)用潛力。作者通過(guò)系統(tǒng)的機(jī)理研究，加深對(duì)酶催化去飽和化機(jī)理的理解，為此反應(yīng)體系的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

葉宇軒博士2013年于北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院獲得學(xué)士學(xué)位，指導(dǎo)教師為王劍波教授和張艷教授。2018年在美國(guó)麻省理工學(xué)院獲得博士學(xué)位，指導(dǎo)教師為Stephen Buchwald教授。2019–2022年在美國(guó)普林斯頓大學(xué)和康奈爾大學(xué)開(kāi)展博士后研究，合作教師為Todd Hyster教授。葉宇軒博士于2022年9月全職加入西湖大學(xué)理學(xué)院擔(dān)任特聘研究員，主要研究方向?yàn)樾滦兔复呋翘烊环磻?yīng)的發(fā)展和應(yīng)用。

葉宇軒課題組現(xiàn)面向國(guó)內(nèi)外招聘博士研究生、博士后、科研助理，歡迎對(duì)酶催化感興趣的同學(xué)申請(qǐng)。課題組主頁(yè)：ye.lab.westlake.edu.cn。