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G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是真核生物中最大的一類膜蛋白，在感知胞外信號和介導胞內(nèi)信息轉(zhuǎn)導中發(fā)揮了重要作用，并參與調(diào)控多種生理過程，與人類疾病密切相關(guān)，是最重要的藥物靶標蛋白家族。GPCR與第二信使環(huán)磷酸腺苷相關(guān)的信號通路中，主要通過刺激型G蛋白（G_s）和抑制型G蛋白（G_i）來區(qū)分細胞內(nèi)不同的信號傳遞方式。了解受體對G_s和G_i信號通路的選擇性機制是GPCR和相關(guān)信號轉(zhuǎn)導領(lǐng)域長期以來的重要科學問題。

5-羥色胺（serotonin, 5-HT）是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，其通過結(jié)合5-羥色胺受體（5-HTR）發(fā)揮調(diào)控食欲、記憶、認知，情緒調(diào)節(jié)和成癮等重要的生理過程，這也使5-羥色胺受體成為抑郁癥、精神分裂癥、偏頭痛等疾病的重要治療靶點。5-羥色胺受體家族是GPCR超家族中最復雜的亞家族之一，其包含12種亞型，不同亞型的受體在人體中發(fā)揮不同的生理功能，并且與不同種類的G蛋白偶聯(lián)。其中5-HT₄、5-HT₆和5-HT₇受體主要偶聯(lián)下游G_s蛋白，5-HT₁和5-HT₅受體主要偶聯(lián)下游G_i蛋白。對于在同一內(nèi)源性配體5-HT激活后，不同亞型的5-羥色胺受體如何偏好地偶聯(lián)下游G蛋白來調(diào)控細胞應答一直困擾著研究人員。

2022年6月16日，中科院上海藥物研究所徐華強研究員團隊，聯(lián)合浙江大學張巖教授團隊以及丹麥哥本哈根大學David E. Gloriam教授團隊等，經(jīng)歷一年投稿，在Molecular Cell雜志上在線發(fā)表了最新的研究成果“GPCRs steer Gi and Gs selectivity via TM5-TM6 switches as revealed by structures of serotonin receptors”，取得了5-羥色胺受體結(jié)構(gòu)和功能領(lǐng)域又一突破性進展，成功解析了5-HT₄、5-HT₆、5-HT₇受體與激活型G蛋白（G_s蛋白）和5-HT₄受體與抑制型G蛋白（G_i蛋白）結(jié)合的復合物三維結(jié)構(gòu)。他們系統(tǒng)性地揭示了小分子配體5-HT和5-CT識別5-羥色胺受體亞型的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，并闡明了5-羥色胺受體選擇性偶聯(lián)G_s蛋白和G_i蛋白的分子機制。

聯(lián)合團隊采用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)分別對5-HT激活5-HT₄、5-HT₆形成的G_s復合物、5-CT激活5-HT₇形成的G_s復合物和5-HT激活5-HT₄形成的G_i復合物進行了結(jié)構(gòu)重塑，最終解析了4個在配體激活狀態(tài)下與不同蛋白的復合物結(jié)構(gòu)，其中5-HT-5-HT₄-G_s復合物結(jié)構(gòu)的分辨率為3.1埃，5-HT-5-HT₆-G_s復合物結(jié)構(gòu)的分辨率為3.3埃，5-CT-5-HT₇-G_s復合物結(jié)構(gòu)的分辨率為3.2埃，5-HT-5-HT₄-G_i復合物結(jié)構(gòu)的分辨率為3.2埃（圖1）。

圖1. 5-HT₄、5-HT₆和5-HT₇受體結(jié)構(gòu)

該團隊將所獲的這三種G_s偶聯(lián)的5-羥色胺受體與G_i偶聯(lián)的5-羥色胺受體進行了結(jié)構(gòu)比較，并進一步與另外已發(fā)表的19種G_s和G_i偶聯(lián)的A類GPCRs結(jié)構(gòu)進行比較。他們發(fā)現(xiàn)，跨膜螺旋TM5和TM6長度作為“macro-switch”來分別確定受體對G_s和G_i的選擇性，且這種TM5-TM6 長度的“macro-switch”由A類GPCRs-G蛋白結(jié)構(gòu)共享。此外，TM5和TM6中的特定殘基充當“micro-switches”以與G_s或G_i形成特定的相互作用。這些結(jié)果展示了A類GPCRs的 G_s和G_i蛋白偶聯(lián)選擇性或混雜的共同機制（圖2）。

為探究G蛋白偏好5-羥色胺受體的假設(shè)，該團隊進行了兩組實驗來檢驗TM5和TM6的長度是GPCR區(qū)分G_s和G_i蛋白的關(guān)鍵因素的假設(shè)。第一組實驗是將5-HT_1A受體的TM6末端螺旋斷裂并且TM5螺旋延伸或5-HT₄、5-HT₇受體的TM5末端螺旋斷裂并且TM6螺旋延伸，功能結(jié)果表明這種改造影響了5-HT₄、5-HT₇受體偶聯(lián)G_s蛋白的能力，然后將5-HT_1A受體由原來G_i偶聯(lián)轉(zhuǎn)變成了G_s偶聯(lián)，這些結(jié)果支持TM5和TM6長度的“macro-switch”是G蛋白選擇性的關(guān)鍵。第二組實驗是將G_i偶聯(lián)的5-HT_1A的TM5-TM6區(qū)域與G_s偶聯(lián)的5-HT₄和5-HT₇受體的TM5-TM6區(qū)域互換。研究結(jié)果表明，嵌合受體5-HT_1A (5-HT₄_P5.50-P6.50)與野生型5-HT₄具有相似的功能，即具有高組成型激活且?guī)缀醪皇芘潴w調(diào)節(jié)。同樣，5-HT_1A (5-HT₇_P5.50-P6.50)顯示出與野生型5-HT7相似的功能，在激動劑誘導下進行的cAMP 積累。如果將5-HT₄和5-HT₇的ICL3替換為5-HT_1A，在激動劑誘導下進行的cAMP積累的能力幾乎喪失，類似于野生型5-HT_1A受體。綜上所述，該團隊以5-羥色胺家族受體為切入點揭示了A類GPCRs的G_s、G_i蛋白偶聯(lián)選擇性機制，并擴展了5-羥色胺受體的配體識別基礎(chǔ)。

圖2. 5-羥色胺受體TM5、TM6對G蛋白選擇性偶聯(lián)的影響

徐華強團隊長期致力于5-羥色胺家族受體的結(jié)構(gòu)與功能研究，并取得了一系列系統(tǒng)性的重要成果。2013年，該團隊于在Science上首次報導了激動劑結(jié)合的5-HT_1B受體的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)¹。2018年，該團隊在Cell Discovery發(fā)表了首個反向激動劑結(jié)合的5-HT_1B受體的晶體結(jié)構(gòu)²。2021年3月，該團隊在Nature上首次報道了5-HT_1A、5-HT_1D、5-HT_1E受體的結(jié)構(gòu)，并揭示了磷脂PI4P（PtdIns4P）和膽固醇調(diào)節(jié)受體功能的機制和受體的本底激活機制³。2021年7月，該團隊在Cell Research上首次報道了5-HT1F受體的結(jié)構(gòu)，并揭示了偏頭痛藥物拉米替坦對該受體的選擇性結(jié)合機制⁴。2022年5月，該團隊在Cell Discovery上首次報道了5-HT_5A受體的結(jié)構(gòu)⁵。

在前期研究基礎(chǔ)上，該成果不僅揭示了A類GPCR選擇性偶聯(lián)G蛋白的分子機制，還填補了5-HT家族受體結(jié)構(gòu)解析的最后空白。該成果首次報道5-HT₄、5-HT₆、5-HT₇受體結(jié)構(gòu)，使所有12種5-HT受體亞型的結(jié)構(gòu)均得到了解析。這些在5-羥色胺受體上系統(tǒng)性的研究極大地豐富我們對5-羥色胺系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能認識，并為開發(fā)治療抑郁癥、精神分裂癥、偏頭痛等疾病的藥物提供了重要基礎(chǔ)。

本課題由徐華強研究員領(lǐng)銜，聯(lián)合浙江大學張巖教授和丹麥哥本哈根大學的David E. Gloriam教授團隊等，精誠合作，全力攻關(guān)，并在中國科學院上海藥物研究所蔣軼研究員和余學奎研究員的協(xié)助下完成。上海藥物研究所黃思婕博士和徐沛雨博士、浙江大學基礎(chǔ)醫(yī)學院研究助理沈丹丹和丹麥哥本哈根大學的Icaro A. Simon為本文共同第一作者。

參考文獻：

1.Wang, C. et al. Structural basis for molecular recognition at serotonin receptors. Science 340, 610-614 (2013).

2.Yin, W. et al. Crystal structure of the human 5-HT1B serotonin receptor bound to an inverse agonist. Cell discovery 4, 1-13 (2018).

3.Xu, P. et al. Structural insights into the lipid and ligand regulation of serotonin receptors. Nature 592, 469-473 (2021).

4.Huang, S. et al. Structural basis for recognition of anti-migraine drug lasmiditan by the serotonin receptor 5-HT1F–G protein complex. Cell Research 31, 1036-1038 (2021).

5.Tan, Y. et al. Structural insights into the ligand binding and Gi coupling of serotonin receptor 5-HT5A. Cell discovery 8, 1-9 (2022).

文章鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276522005299?dgcid=coauthor

參考資料：http://www.simm.cas.cn/web/xwzx/kydt/202206/t20220617_6462601.html