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近日，山西大學(xué)分子科學(xué)研究所陰彩霞教授課題組合成了探針Ly-NT-SP，用于溶酶體中SO₂的檢測。探針Ly-NT-SP在pH 5.0的PBS溶液中在535 nm有明顯的熒光發(fā)射。紫外光照射后，Ly-NT-SP中的螺吡喃基團異構(gòu)化為半花菁形式（Ly-NT-MR），其熒光發(fā)射峰紅移至630 nm。此外，光控的Ly-NT-SP到Ly-NT-MR的異構(gòu)化反應(yīng)生成了一個C=C-C=N⁺基團，該基團能夠與SO₂發(fā)生Michael加成反應(yīng)，加成產(chǎn)物在535 nm處具有明顯的熒光發(fā)射。體外研究表明，光活化Ly-NT-MR對SO₂具有顯著的選擇性，檢出限為4.7 μM。該探針首次成功地應(yīng)用于熱休克過程中溶酶體內(nèi)SO₂濃度變化監(jiān)測。（DOI:10.1021/jacs.9b13936）

紫外光照射后，螺吡喃（SP）的結(jié)構(gòu)可以可逆地轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>半花菁（MR）態(tài)。由于萘酰亞胺給體與MR受體之間存在共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）過程，可以觀察到綠色熒光到紅色熒光的“紅移”熒光響應(yīng)。特別是紫外激活的MR態(tài)包含一個特殊的碳碳雙鍵，該雙鍵可受到SO₂的原位進攻。這種原位紫外激活策略使作者能夠以比率測量的方式準(zhǔn)確監(jiān)測溶酶體中的SO₂，這在很大程度上避免了探針在細胞中假陽性信號的干擾。

圖1. Ly-NT-SP的分子設(shè)計，SO₂的傳感機制以及在紫外輻射控制下的原位反應(yīng)示意圖。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

探針Ly-NT-SP在PBS溶液中的熒光發(fā)射在535 nm處。作者發(fā)現(xiàn)，紫外照射120 s之后，探針熒光光譜中535 nm處的最大發(fā)射紅移到630 nm。紫外吸收光譜中，隨著紫外光照射時間的增加，探針在540 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰。以上光譜變化表明紫外光控制探針由Ly-NT-SP向Ly-NT-MR的轉(zhuǎn)變是有效的，同時該轉(zhuǎn)化過程伴隨著由萘酰亞胺熒光團到半花菁熒光團熒光共振能力轉(zhuǎn)移過程。隨后作者測試了探針Ly-NT-MR在SO₂存在下的熒光光譜和紫外可見吸收光譜變化。加入Na₂SO₃（作為SO₂供體）后，在熒光光譜中，探針630 nm處的發(fā)射帶向前移動至535 nm；紫外吸收光譜中，540 nm處的Ly-NT-MR吸收帶隨之逐漸減小。

 圖2. 探針Ly-NT-SP用紫外光照射120 s以及加入Na₂SO₃后的光譜圖。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

MTT法測試探針結(jié)果表明探針（10 μM）對HeLa細胞無明顯毒副作用。之后在紫外線照射不同時間條件下檢測細胞活力，發(fā)現(xiàn)紫外線照射過程的光毒性低。然后作者在HeLa細胞中檢測了Ly-NT-SP的細胞內(nèi)光控方式。HeLa細胞在37 ℃下與Ly-NT-SP孵育20分鐘，再用紫外光和可見光連續(xù)照射。Ly-NT-SP處理的HeLa細胞在綠色通道中顯示出明顯的綠色熒光。然而紫外線照射后，綠色通道的熒光消失，紅色通道出現(xiàn)明顯的紅色發(fā)射，這是由于非活性Ly-NT-SP轉(zhuǎn)化為SO₂活性的Ly-NT-MR的結(jié)果。然后，在可見光照射下，觀察到綠色熒光明顯增強，紅色通道減少。這些結(jié)果清楚地驗證了探針Ly-NT-SP對細胞內(nèi)光致變色作用的光控策略。

 圖3. 用Ly-NT-SP孵育細胞的共聚焦顯微鏡圖像。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

此外，作者還研究了探針Ly-NT-SP對活細胞中外源和內(nèi)源SO₂檢測的檢測性能。用Ly-NT-SP預(yù)處理HeLa細胞15分鐘，然后用紫外線照射2分鐘。在紅色通道中觀察到強烈的紅色熒光。外源SO₂（Na₂SO₃）加入后，綠色通道中的熒光信號隨著紅色通道中熒光信號的降低而顯著增加。為了評價Ly-NT-SP對內(nèi)源性SO₂的檢測能力，用1 μg/mL脂多糖（LPS）預(yù)處理HeLa細胞，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生低水平的內(nèi)源性亞硫酸鹽。與用Ly-NT-SP處理和紫外光照射的細胞相比，脂多糖預(yù)處理的HeLa細胞顯示出較強的綠色熒光，同時伴有相對較弱的紅色熒光。綜上所述，探針Ly-NT-SP能夠同時跟蹤活細胞中的外源和內(nèi)源SO₂濃度變化。

 圖4. 外源性Na₂SO₃和內(nèi)源性Na₂SO₃（脂多糖預(yù)處理）對Ly-NT-MR的共聚焦顯微鏡成像。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

接下來，作者測試了熱休克情況下探針Ly-NT-SP 在HeLa細胞內(nèi)對SO₂濃度變化的成像能力。HeLa細胞首先與Ly-NT-SP在37 ℃下孵育20分鐘，然后用紫外光照射。之后再將細胞在37、39、41和43 ℃下進一步孵育30分鐘，拍攝共焦顯微鏡圖像。當(dāng)溫度升高時，紅色熒光通道熒光信號明顯降低，而在綠色通道中，觀察到熒光增強。綠色與紅色的發(fā)射比隨著溫度的升高而增加。而在細胞孵育SO₂抑制劑甲醛以后，發(fā)現(xiàn)綠色與紅色熒光發(fā)射比值未發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果表明，熱休克過程導(dǎo)致了溶酶體內(nèi)SO₂濃度升高。此外，未孵育NAC組細胞與孵育NAC組細胞相比，綠色與紅色熒光發(fā)射比值降低，可能的原因是NAC作為抗氧化劑抑制了細胞內(nèi)SO₂的增加。

圖5. 不同溫度下，對HeLa細胞進行紫外照射后的共聚焦顯微鏡觀察。(圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

作者進一步研究了SO₂在熱休克小鼠體內(nèi)的抗氧化作用。將6-8周齡的雄性小鼠隨機分為5個實驗組，對照組、HS組、HS+NAC組、HS+HCHO組和HS+Na₂SO₃組。首先，在腸道組織中驗證了紫外輻射將Ly-NT-SP轉(zhuǎn)化為Ly-NT-MR的作用。與Ly-NT-SP孵育的回腸切片在紅色通道中顯示出輕微的紅色發(fā)射。然后在暗室中用紫外線照射組織100秒，觀察到紅色通道中的紅色熒光明顯增強，綠色熒光同時減弱。這些結(jié)果表明，紫外光可以在組織水平將探針Ly-NT-SP轉(zhuǎn)化為Ly-NT-MR。然后，HS組預(yù)處理回腸切片在37 ℃下與Ly-NT-SP孵育30分鐘，并暴露在紫外線下3分鐘，然后在37 ℃下再培養(yǎng)30分鐘。與對照組相比，在HS處理的腸組織中，發(fā)現(xiàn)紅色通道信號明顯減少，綠色熒光信號增加。與對照組相比，HS處理小鼠的綠色和紅色熒光比值增加了4.1倍。對于用Na₂SO₃處理的小鼠，獲得的組織成像在綠色通道顯示出顯著的熒光增強，而紅色通道的圖像顯示出很弱的熒光信號。此外，與對照組相比，注射Na₂SO₃引發(fā)的最明顯的熒光比變化高達4.6倍。這些結(jié)果表明，熱應(yīng)激引起小鼠小腸SO₂的上調(diào)，這證實了Ly-NT-SP對SO₂精確成像的優(yōu)勢。除此之外，在Na₂SO₃和NAC預(yù)處理小鼠中觀察到熱應(yīng)激引起的腸道損傷減少。這些結(jié)果表明，增加的SO₂可以通過抵御過量生成的ROS，在很大程度上減輕中暑引起的腸道損傷。

 圖6. HS預(yù)處理腸道組織中SO₂的共聚焦顯微鏡圖像。 (圖片來源：J. Am. Chem. Soc. )

總結(jié)：山西大學(xué)陰彩霞課題組成功地開發(fā)了一種光激活型熒光探針，用于評估溶酶體中SO₂濃度的變化。Ly-NT-SP探針顯示了良好的溶酶體靶向性，能夠在紫外光照射下實現(xiàn)對SO₂進行精確檢測。Ly-NT-SP也被成功地用于HeLa細胞中外源和內(nèi)源SO₂的可視化成像。此外，Ly-NT-SP首次用于跟蹤熱休克期間溶酶體SO₂的變化。研究結(jié)果表明內(nèi)源性增加的SO₂在調(diào)節(jié)細胞氧化應(yīng)激中起重要作用，此外，增加的SO₂可保護小腸免受熱應(yīng)激引起的損傷。 

撰稿人：馮