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近年來，具有熒光響應(yīng)的超分子組裝體已被學(xué)者廣泛地用于細(xì)胞成像，尤其是靶向細(xì)胞器的成像。而溶酶體作為一類重要的細(xì)胞器，其參與了許多細(xì)胞活動(dòng)，如聚合物地降解、分泌過程、質(zhì)膜修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)傳送、能量代謝等，也受到靶向成像的關(guān)注。比如，基于羅丹明和釕配合物的靶向溶酶體探針已被文獻(xiàn)報(bào)道。

由于近紅外熒光發(fā)射在生物樣品光損傷輕微性、生物分子自發(fā)熒光干涉微弱性、深層組織滲透性等方面的優(yōu)勢，使得具有近紅外熒光發(fā)射的超分子組裝體在細(xì)胞成像上受到廣泛關(guān)注。然而，通常有機(jī)染料分子很難達(dá)到近紅外發(fā)射以及組裝過程存在的聚集誘導(dǎo)熒光淬滅，所以具有近紅外熒光發(fā)射的超分子組裝體則很少被報(bào)道。

在超分子組裝體中，一些熒光靜寂的有機(jī)染料可以受主-客體絡(luò)合、聚集誘導(dǎo)發(fā)光作用下產(chǎn)生各式各樣的熒光發(fā)射。同時(shí)，另一些染料分子的熒光也會(huì)受這兩種方式的影響發(fā)生發(fā)射峰的位移。在超分子組裝體中，有機(jī)染料通常通過形成J聚集體或H聚集體而發(fā)生熒光發(fā)射強(qiáng)度或波長的變化。在J聚集體中，有機(jī)染料的熒光發(fā)射通常發(fā)生紅移和增強(qiáng)，而在H聚集體中則發(fā)生藍(lán)移和淬滅。

葫蘆脲和杯芳烴作為兩類常見的大環(huán)化合物，已被廣泛地用于構(gòu)筑超分子組裝體。在眾多葫蘆脲同系物中，葫蘆[8]脲（CB[8]）由于可以包合兩分子客體而被廣泛地用來構(gòu)筑超分子聚集體。而對于兩親性的易溶于水的對磺酸杯[4]芳烴，由于其可以發(fā)揮杯芳烴誘導(dǎo)聚集作用也受到青睞，被用來構(gòu)筑超分子聚集體。

在此基礎(chǔ)上，南開大學(xué)劉育教授團(tuán)隊(duì)，設(shè)計(jì)合成了在625納米發(fā)射微弱熒光的蒽基吡啶嗡鹽分子（ENDT），其依次與CB[8]、下緣取代的對磺酸杯[4]芳烴（SC4AD）組裝形成二級超分子組裝體。該組裝體表現(xiàn)出較強(qiáng)的近紅外熒光發(fā)射，而進(jìn)一步被用在靶向溶酶體細(xì)胞成像上。（組裝過程如圖1所示）

圖1. 文中報(bào)道的具有近紅外熒光發(fā)射的二級組裝體的組裝示意圖

熒光分子ENDT與CB[8]的組裝形式與過程。

（1）作者們通過紫外Job實(shí)驗(yàn)確認(rèn)ENDT與CB[8]形成1:1的絡(luò)合物。進(jìn)一步通過紫外滴定實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)ENDT與CB[8]形成n:n的雪橇狀聚集體（如圖1或圖2c所示）。

（2）一維核磁氫譜滴定實(shí)驗(yàn)（如圖3所示）表明ENDT與CB[8]的組裝過程與作用范圍。二維核間奧弗豪澤效應(yīng)譜（NOESY）進(jìn)一步明確ENDT的乙基吡啶嗡鹽基團(tuán)包合在CB[8]空腔內(nèi)（如圖4所示）。

綜合（1）、（2）實(shí)驗(yàn)過程，作者們明確了ENDT與CB[8]的組裝形式，形成如圖1所示（或如圖2c所示）的納米棒（nanorods）結(jié)構(gòu)。

圖2. 在1:1比例下，ENDT與CB[8]可能形成的3種組裝體的示意圖

圖3. ENDT與CB[8]的核磁滴定圖

圖4. ENDT/CB[8]一級組裝體的二維NOESY圖

ENDT/CB[8]與SC4AD的二級組裝過程。

（1）如圖5b和5c所示，固定ENDT和CB[8]的濃度不變且相等（[ENDT] = [CB[8]] = 0.02 mM），隨著SC4AD的加入至0.01 mM時(shí)，透光率出現(xiàn)急劇減弱，而這一點(diǎn)說明由于達(dá)到正、負(fù)電荷數(shù)平衡，SC4AD與ENDT/CB[8]一級組裝體發(fā)生完全組裝。而繼續(xù)增加SC4AD的量，過量的SC4AD則會(huì)包裹ENDT/CB[8]一級組裝體形成疏水層，同時(shí)透光率發(fā)生部分恢復(fù)。當(dāng)SC4AD的濃度超過0.03 mM時(shí)，因?yàn)槌^SC4AD本身的臨界聚集濃度，透光率發(fā)生逐漸減弱。

（2）圖5a表明，ENDT沒有丁達(dá)爾現(xiàn)象，ENDT/CB[8]一級組裝體僅有微弱的丁達(dá)爾現(xiàn)象，ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體則表現(xiàn)出明顯的丁達(dá)爾現(xiàn)象。說明ENDT與CB[8]/SC4AD發(fā)生二級組裝形成納米級顆粒。

圖5. （a）ENDT、ENDT/CB[8]一級組裝體、ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的丁達(dá)爾現(xiàn)象圖；（b）隨著SC4AD濃度的變化，ENDT/CB[8]一級組裝體的透光率變化圖；（c）圖6b中700納米處的透光率隨SC4AD濃度變化的趨勢圖

ENDT與CB[8]一級組裝、及與SC4AD二級組裝的熒光變化。

作者們通過熒光光譜實(shí)驗(yàn)、對照實(shí)驗(yàn)細(xì)致分析ENDT與CB[8]一級組裝、SC4AD與ENDT/CB[8]一級組裝體進(jìn)行二級組裝的熒光變化（如圖6所示），得出下列結(jié)論。

（1）ENDT與CB[8]發(fā)生一級組裝后，最大發(fā)射波長發(fā)生紅移同時(shí)出現(xiàn)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的近紅外發(fā)光。他們推斷ENDT中的吡啶嗡鹽與蒽環(huán)間的C—C單鍵的旋轉(zhuǎn)受到限制而表現(xiàn)出熒光增強(qiáng)；ENDT/CB[8]一級組裝體形成J聚集體，是熒光發(fā)射發(fā)生紅移的原因。

（2）SC4AD與ENDT/CB[8]一級組裝體進(jìn)行二級組裝后，熒光發(fā)射繼續(xù)發(fā)生顯著增強(qiáng)。他們推斷隨著SC4AD的加入，一方面進(jìn)一步限制ENDT分子內(nèi)相關(guān)單鍵的旋轉(zhuǎn)，另一方面可以形成疏水空間而屏蔽水分子對ENDT的熒光影響。

圖6. （a）自然光下，ENDT水溶液、ENDT/CB[8]一級組裝體的水溶液的照片；（b）ENDT水溶液（0.02 mM）、ENDT/CB[8]一級組裝體的水溶液（[ENDT] = [CB[8]] = 0.02 mM）的紫外吸收光譜圖；（c）395納米下，ENDT水溶液（0.02 mM）、ENDT/CB[8]一級組裝體的水溶液（[ENDT] = [CB[8]] = 0.02 mM）、ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的水溶液（[ENDT] = [CB[8]] = 0.02 mM，[SC4AD] = 0.04 mM）的熒光照片；（d）激發(fā)波長為470納米下，ENDT水溶液（0.02 mM）、ENDT/CB[8]一級組裝體的水溶液（[ENDT] = [CB[8]] = 0.02 mM）、ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的水溶液（[ENDT] = [CB[8]] = 0.02 mM，[SC4AD] = 0.04 mM）的熒光發(fā)射光譜圖。

ENDT/CB[8]一級組裝體、ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的掃描電鏡圖、透射電鏡圖及動(dòng)態(tài)光散射數(shù)據(jù)。

（1）掃描電鏡（SEM）圖（如圖7a所示）和透射電鏡（TEM）圖（如圖7b所示）表明ENDT/CB[8]一級組裝體形成納米棒狀結(jié)構(gòu)；粉末衍射（PXRD）（如圖8所示，）顯示ENDT/CB[8]一級組裝體形成有序的排列，進(jìn)一步佐證了前文中ENDT與CB[8]形成n:n的雪橇狀聚集體的結(jié)論。

（2）掃描電鏡（SEM）圖（如圖7d所示）和透射電鏡（TEM）圖（如圖7e所示）表明ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體形成納米顆粒結(jié)構(gòu)。

（3）動(dòng)態(tài)光散射（DLS）數(shù)據(jù)表明ENDT/CB[8]一級組裝體的動(dòng)力學(xué)平均半徑為530納米（如圖7c所示），ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的動(dòng)力學(xué)平均半徑為360納米（如圖7f所示），而這兩個(gè)平均值與透射電鏡圖顯示的結(jié)果接近。

圖7. （a）ENDT/CB[8]一級組裝體的掃描電鏡圖；（b）ENDT/CB[8]一級組裝體的透射電鏡圖；（c）ENDT/CB[8]一級組裝體的動(dòng)態(tài)光散射數(shù)據(jù)；（d）ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的掃描電鏡圖；（e）ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的透射電鏡圖；（f）ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體的動(dòng)態(tài)光散射數(shù)據(jù)。

圖8. ENDT/CB[8]一級組裝體的粉末衍射圖。 

ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體用于靶向溶酶體細(xì)胞成像。

（1）作者們選用人體肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）作為靶向溶酶體細(xì)胞，使用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞經(jīng)ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體染色后的分布情況。

（2）對照實(shí)驗(yàn)中，A549細(xì)胞僅被ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體染色后，才產(chǎn)生明顯的紅色熒光（如圖9所示）。

（3）A549細(xì)胞可以被ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體染色，同時(shí)被染色的區(qū)域與使用商用LysoTracker Blue染料染色的區(qū)域接近（如圖10所示）。

（4）濃度在0.08毫摩爾/升以內(nèi)的ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體對A549細(xì)胞的毒性十分微弱（如圖11所示）。

圖9. （a）A549細(xì)胞經(jīng)ENDT染色后的共聚焦熒光顯微圖；（b）A549細(xì)胞經(jīng)ENDT/CB[8]一級組裝體染色后的共聚焦熒光顯微圖；（c）A549細(xì)胞經(jīng)ENDT/CB[8]/SDOBS組裝體染色后的共聚焦熒光顯微圖；（d）A549細(xì)胞經(jīng)ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體染色后的共聚焦熒光顯微圖。

圖10. （a）A549細(xì)胞經(jīng)ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體染色后的共聚焦熒光顯微圖；（b）A549細(xì)胞經(jīng)LysoTracker Blue染料染色后的的共聚焦熒光顯微圖；（c）a圖與b圖的疊加圖。

圖11. 不同溶度下ENDT/CB[8]/SC4AD二級組裝體對A549細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞相對異常的數(shù)據(jù)。 

小結(jié)：劉育教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一例ENDT熒光分子與CB[8]、SC4AD分等級組裝，并產(chǎn)生兩級增強(qiáng)的近紅外熒光發(fā)射的超分子組裝體。第一級中，沒有近紅外熒光發(fā)射的ENDT分子，與CB[8]組裝形成納米棒同時(shí)產(chǎn)生近紅外熒光發(fā)射并表現(xiàn)出熒光增強(qiáng)；第二級中，ENDT/CB[8]一級組裝體與SC4AD二次組裝形成納米顆粒，同時(shí)近紅外熒光發(fā)射再次發(fā)生增強(qiáng)。進(jìn)一步地，作者們將該二級組裝體應(yīng)用在靶向溶酶體細(xì)胞成像上。

文獻(xiàn)連接：X.-M. Chen, Y. Chen, Q. Yu, B.-H. Gu, Y. Liu*, Supramolecular Assemblies with Near-Infrared Emission Two-Stage Mediated by Cucurbituril and Amphiphilic Calixarene for Lysosome-Targeted Cell Imaging. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, DOI: 10.1002/anie.201807373